Главная > Общая иммунология > 12.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ HLA-ФЕНОТИПА

12.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ HLA-ФЕНОТИПА

28/06/2011 Комментарии отключены

На мембране клеток организма присутствуют продукты генов всех Локусов, размещенных на обеих нитях 6-й хромосомы. Это означает, Что HLA-гены наследуются по кодоминантному типу, т. е. одну хроМосому ребенок наследует от матери, а другую — от отца. Как уже Упоминалось, совокупность генов, расположенных на одной хромосоМе, составляет гаплотип. Таким образом, у человека два гаплотипа и Каждая клетка организма несет на себе диплоидный набор антигенов Системы        один из которых кодируется        матери, а друГой— отца. Исключение составляют половые клетки (яйцеклетка и сперматозоид), каждая из которых содержит в своем ядре только по одному гаплотипу.

Антигены гистосовместимости, выявляемые на клетках конкретного человека, составляют HLA-фенотип. Для его определения необходимо

Произвести фенотипирование клеток индивида. Как правило, "типиРуются" лимфоциты периферической крови. В данном случае не из-142

Вестно, какие именно HLA-антигены каким из двух гаплотипов роди­телей кодируются. Чтобы это определить, необходимо произвести типирование родителей, после чего можно установить гаплотипы об­следуемого и, соответственно, его генотип — последовательность рас­положения генов на хромосоме. На практике HLA-фенотип записы­вают, соблюдая числовой порядок HLA-антигенов, согласно номенк­латуре. Например:

HLA-фенотип субъекта — Al,2; В5,12; DR2,5; DQ3,4.

В данном случае можно предположить 100 вариантов гаплотипов родителей, 50 из которых принадлежат матери, а 50 — отцу. Опреде­лить их, как уже указывалось, можно только посредством типирования.

Если в результате типирования определяется только один антиген по какому-либо локусу, то это является следствием гомозиготности индивида по данному гену. Следовательно, от отца и матери унасле­дована аллель одинаковой специфичности.

До настоящего времени в большинстве лабораторий HLA-A, В, С И DR-антигены определяют при помощи серологических методов, в чаСтности, лимфоцитотоксического теста. Этот тест основан на способ- 
 Ности aHTH-HLA-антител в присутствии комплемента разрушать лимФоциты, несущие соответствующие антигенные детерминанты. Гибель Клеток демонстрируется при помощи добавления трипанового синего. 
 При этом мертвые поврежденные клетки окрашиваются, и под микроСкопом учитывается их количество. Применяется также микрометод, Являющийся модификацией лимфоцитотоксического теста. Для его поСтановки используют всего лишь 1 мкл типирующих сывороток, а такЖе небольшое количество клеток. Микролимфоцитотоксический тест Является стандартным и используется во всех типирующих лаборатоРиях мира. Набор типирующих сывороток (типирующая панель) создаЕтся в результате кропотливых исследований из образцов сывороток, 
 Содержащих анти-НЬА-антитела. Эти антитела могут индуцироватьСя во время беременности, при        а также в результате Пересадки аллотрансплантатов. Основными продуцентами типирую- 
Щих сывороток являются многорожавшие женщины, которые иммуни-
Зируются HLA-продуктами мужа во время вынашивания плода.

Представления о строении системы HLA развивались и развива-
Ются в течение всего периода ее изучения, однако за последние годы
Произошел качественный скачок в развитии этой проблемы. Ранее,
Когда основным объектом исследования служили только антигены
Системы HLA, представления о комплексе генов        могли форми-

Роваться в основном на анализе косвенных данных, включающих изу­чение антигенов системы HLA в популяциях, семейном анализе, реак­

Циях, субстратом которых были HLA-антигены. Теперь, благодаря развитию молекулярной генетики и иммунохимии, появилась возмож­ность не только проводить тонкий анализ HLA-антигенов, но и изучить сами гены HLA. Особый прогресс в этом направлении был достигнут после открытия и внедрения в исследования в области изучения систе­мы HLA метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющего анализировать необходимые для исследований участки ДНК, что, в свою очередь, открыло широкие возможности для быстрого и точно­го анализа молекулярного полиморфизма HLA.

Реакция амплификации ДНК in vitro основана на способности моле­кул нуклеотидтрифосфатов в присутствии ДНК-полимеразы при со­ответствующих условиях (рН, ионная сила раствора, температура) образовывать на матрице (одноцепочечной ДНК) комплементарную цепь. Необходимым условием синтеза является наличие праймера — олигонуклеотида, который синтезируется искусственно.

Для повышения точности реакции и увеличения чувствительности, как правило, используют пару праймеров. Управление ходом реак­ции идет с помощью изменения температурных условий. При опреде­ленной температуре (зависит от нуклеотидного состава ДНК) идет расхождение двойной цепи ДНК — плавление. Снижение темпера­туры приводит к обратному процессу — соединению комплементар­ных цепей —отжигу. При избытке праймеров в растворе вероятность отжига на ДНК-матрице праймера гораздо выше, чем присоединение полной цепи. И, поскольку праймер меньше матрицы, начинается ак­тивное достраивание (синтез) комплементарной цепи. Скорость дост­ройки достигает нескольких сотен (иногда более тысячи) нуклеотидов в секунду. Таким образом, в конце цикла имеется удвоенный набор ДНК (точнее не всей ДНК, а участка, ограниченного праймерами).

Снова повышается температура — плавление — отжиг — синтез — и в растворе уже 4 копии исходной матрицы. Количество копий (ампли-фикатов) растет в геометрической прогрессии, и после 30—40 циклов в растворе находится от 10 млн до 10 млрд копий исходной матрицы. Причем, поскольку имеется пара праймеров, амплификаты будут стро­го определенного размера. Такое количество ДНК можно визуально

Обнаружить, например, при электрофорезе на агарозном геле с бро­мидом

Существует несколько методик проведения полимеразной цепной

Реакции.

SSO (sequence specific oligonucleotide) — неспецифическая амплифи­кация исследуемого участка (локуса) ДНК с последующей специфи­ческой гибридизацией с мечеными ДНК-зондами.

RFLP (restriction fragment length polymorphism) — неспецифическая амплификация с последующим переваром продуктов амплификации набором рестриктаз. По длине полученных продуктов судят о нуклео-тидном составе.

SSCP (single-strand conformation ро1утофЫзт) — различие аллелей по электрофоретической подвижности одноцепочечных фрагментов ДНК, обусловленной характерными элементами вторичной структуры.

SSP (sequence specific primer) — наиболее распространенная и тех­нически простая методика, когда каждому аллельному варианту либо группе аллелей соответствует своя пара праймеров. Разработана но­вая модификация этой методики — MSSP (mixture of sequence specific

Primer) — позволяющая за счет более рационального выбора прайме-ров и режимов амплификации выявить сразу несколько специфично-

Стей, используя одну пробирку и одну дорожку на геле. Длительность определения — около ч.

Как было сказано выше, для выявления классических антигенов системы HLA локусов А, В, С и DR используется серологическая ре­акция микролимфоцитотоксичности, в которой применяются специ­альные антисыворотки, содержащие антитела к указанным антигенам. Молекулярное же типирование позволяет с s помощью метода ПЦР выявлять различные аллели HLA на уровне ДНК. Это дает возмож­ность выявлять те аллели генов HLA класса II, которые трудно выяв­ляются с помощью серологического типирования, либо вовсе не вы­являются. Так, например, с помощью серологической техники в локу­се DR выявлено 14 антигенов, а с помощью ДНК-типирования — более 100 аллелей.

Установление новых, реально функционирующих аллелей застави­ло пересмотреть ранее существовавшую номенклатуру HLA, и теперь

Принято четырехзначное обозначение (например А0101 вместо А1). В

Тех же случаях, когда установлено несколько аллелей, которые по пре­жним представлениям кодировали различные субтипы одного анти­гена (например в HLA-A2 было установлено 12 таких субтипов), то теперь их обозначают как различные аллели, имеющие общие первые

Цифры. Например от HLA0201 до HLA0212 или от HLAB2701 до HLAB2707.

Вышесказанное прямо относится только к классу I HLA, где поли­морфной является только одна цепь. В классе II из-за возможного по­лиморфизма как бета, так и альфа генов, установленные аллели обо­значают в зависимости от цепи, несущей вариабельный участок ДНК, определяющий специфичности, например DQA1-0501 и DQB1-0501.

В настоящее время селекция донора и реципиента по HLA-антиге-

Нам с использованием ДНК-типирования стала рутинным методом в типирующих лабораториях трансплантационных центров. Данные последних лет показывают, что выживаемость трупного почечного аллотрансплантата в течение 1 года при подборе пары донор-реципи­ент с помощью ДНК-типирования составила 90%. В то же время при подборе пары с помощью серологического типирования эта же цифра оказалась равной 68%.

Не менее важным является определение HLA-фенотипа с помощью ДНК-типирования при решении вопроса о спорном отцовстве. В этом довольно ответственном и деликатном вопросе использование ПЦР также повышает точность анализа.

Наконец, немаловажным является практическое применение ПЦР для идентификации ДНК микроорганизмов при проведении диагно­стики инфекционной патологии. Опыт, накопленный за последнее вре­мя, показывает огромные перспективы использования ПЦР в этой области.

Мобильный телефон samsung i9192 galaxy купить мобильный телефон samsung galaxy..

Теги: , , , , , , , ,

Комментарии закрыты.